Genomet til høyere eukaryoter har en kompleks tredimensjonal romlig struktur, slik som kromatinsløyfer (kromatinløkker), topologisk assosierte domener (TAD), aktive/inaktive kromatinrom (A/B-rom) og kromosomale domener (kromosomterritorier) ved forskjellige skalaer. Disse strukturene er viktige for opprettholdelse av genomstabilitet, den nøyaktige reguleringen av genuttrykk, og dermed påvirke celleskjebnebestemmelse og fenotypeetablering. Den klassiske 3D-strukturen til genomet blir hovedsakelig avslørt av forskjellige høykapasitetsteknologier representert ved kromosomkonformasjonsfangst (3C) og dets avledede metoder som 4Cs, 5C, Hi-C og ChIA-PET. Disse teknologiene kan fange parvise DNA-sekvenser i kjernen, men klarer ikke å fange synergistiske multisite-interaksjoner (flerveiskontakt) og enkeltmolekyltopologi (enkeltalleltopologi) i cellepopulasjoner. Videre endres genomiske 3D-strukturer dynamisk under cellesyklus, utvikling og differensiering og er assosiert med kromatininteraksjoner i flere gener og regulatoriske intervaller. Å oppnå kromosom-enkeltmolekyltopologien i en cellepopulasjon er viktig for å undersøke den dynamiske foldemekanismen til genomet og assosiasjonen med genregulerende funksjoner.
Hou Chunhui, en forsker ved Kunming Institute of Zoology of Chinese Academy of Sciences, og Xiao Chuanle, en assisterende forsker ved Zhongshan Ophthalmology Center ved Sun Yat-sen University, publiserte en forskningsartikkel med tittelen High-throughput Pore-C avslører enkeltallelen topologi og celletypespesifisitet av 3D-genomfolding i Nature Communications (Nature Communications). Dette arbeidet optimerer en høyhastighets Pore-C-metode, øker deteksjonsfluksen av høyere ordens kromatininteraksjoner betydelig, og avslører enkeltmolekylets topologiske mangfold og cellespesifisiteten til det tredimensjonale genomet.
Årsaken til den relativt lave sekvenseringsgjennomstrømningen til Pore-C-teknologien kan være blokkeringen av den sekvenserende nanopore-kjernen fordi proteinet som er tverrbundet til DNA ikke er fullstendig fjernet. For å løse dette problemet, optimaliserte studier enzymatiske forhold, testet strategien for multippel proteolyse og bruk av blandede proteaser, økte sekvenseringsutbyttet med omtrent 80 prosent, og nesten multiplisert brukskostnaden for denne teknologien. I tillegg utviklet vi MapPore-C-justeringsprosessen ved å integrere NGMLR- og Minimap2-justeringsalgoritmer, som forbedret justeringsnøyaktigheten og lav datautnyttelse betydelig. I mellomtiden bekreftet vi at HiPore-C i høy grad kan reprodusere Hi-C-fangstbaserte kromatinsløyfer, topologiassosierte domener og kromatinregionrom sammenlignet med Hi-C-data. Videre undersøkte studien den høye ordens interaksjonen mellom kromosomer, de fleste interaksjoner forekommer ikke mellom telomerer og sentrioler, men i genomiske regioner, og danner to transkripsjonsaktivitet forskjellige interaksjonsknutepunkter, ett nav-gentetthet, forsterkertetthet og aktiv tilstand av kromatinrelatert epigenetisk modifikasjonsnivåene er høyere. Studien fant også at høyfrekvente interaksjoner på tvers av kromosomer forekommer mellom tRNA-genanrikede områder av flere kromosomer. HiPore-C høyordens interaksjoner forekommer ikke bare innenfor TAD og rom, men spenner også over flere rom, topologisk relaterte domener og kromatinsløyfer. Kromatininteraksjonskart basert på direkte og indirekte DNA-fragmentinteraksjoner ligner generelt på konvensjonelle Hi-C-kart, men indirekte DNA-fragmentinteraksjoner er mer sannsynlig å spenne over flere strukturelle enheter. Studiene ovenfor avslører universaliteten til eksistensen av interaksjoner på tvers av kromatindomener og fremhever fordelene og viktigheten av HiPore-C-teknologi for å løse tredimensjonale høyordens interaksjoner på enkeltmolekylnivå.
Vi diskuterer enkeltmolekyltopologiklynger i topologien til forskjellige typer celler. Disse strukturelle klyngene er grunnlaget for dannelsen av sub-TAD-lignende (subTAD-lignende) domener, med åpenbar cellespesifisitet, noe som indikerer at enkeltmolekylært topologisk mangfold er grunnlaget for TAD-domenedeling i cellepopulasjoner, og er av stor betydning for utforske forholdet mellom romlig organisering av genom og cellespesifikk genuttrykk. Videre brukte studier HiPore-C-data for å sammenligne høyere-ordens interaksjoner i -globin locus i erytroide GM12878-celler. Vi fant at multi-site simultane, cellespesifikke enhancer-promoter-sentre dannes mellom de humane ε-og-globingen-promotorene og flere enhancers, og at denne interaksjonen kan være dynamisk. Evnen til HiPore-C til å fange opp både høyordens interaksjon og DNA-metyleringsstatus, og den positive korrelasjonen mellom DNA-metyleringssignal og interaksjonsstyrken mellom kromatinsløyfeankre, i tillegg kan typen kromatinrom skilles nøyaktig ut i henhold til DNA metyleringsnivå (A vs B). Denne studien etablerte HiPore-C-teknikken, som omfattende kan beskrive mangfoldet av enkeltmolekyltopologi, og avslørte at den dynamiske foldingen av enkeltmolekyltopologi er mer kompleks enn tidligere antatt, noe som ytterligere forbedret erkjennelsen av loven om tredimensjonal genomfolding .
